El iPSC | Formiato de calcio Co., Ltd de Gansu

Biología de las comunicaciones volumen 6, número de artículo: 789 (2023) Citar este artículo

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El colesterol es un componente estructural esencial de la membrana y precursor de la hormona esteroide, y participa en numerosos procesos de señalización. Los astrocitos regulan la homeostasis del colesterol cerebral y suministran colesterol a las necesidades de las neuronas. El transportador A1 del casete de unión a ATP (ABCA1) es el principal transportador de salida de colesterol en los astrocitos. Aquí mostramos una homeostasis del colesterol desregulada en astrocitos generados a partir de células madre pluripotentes inducidas humanas (iPSC) derivadas de hombres con síndrome de X frágil (FXS), que es la causa más común de discapacidad intelectual hereditaria. Los niveles de ABCA1 se reducen en los astrocitos humanos y de ratón FXS en comparación con los controles. La acumulación de colesterol se asocia con un aumento de desmosterol y fosfolípidos poliinsaturados en el lipidoma de los astrocitos del ratón FXS. Las respuestas astrocíticas anormales a la exposición a citocinas junto con los perfiles antiinflamatorios y de citocinas alterados del secretoma de astrocitos FXS humanos sugieren la contribución de factores inflamatorios a la homeostasis alterada del colesterol. Nuestros resultados demuestran cambios en el metabolismo de los lípidos astrocíticos, que pueden regular de manera crítica las propiedades de la membrana y afectar el transporte de colesterol en los astrocitos del FXS, lo que proporciona un objetivo para la terapia en el FXS.

El colesterol es un componente estructural esencial de las membranas biológicas y un precursor de las hormonas esteroides1. Es crucial para la formación y función de sinapsis, ya que se requiere un alto contenido de colesterol en las balsas lipídicas2. La interacción del colesterol con varios canales iónicos puede facilitar o inhibir la función del canal y contribuir a la regulación de la actividad neuronal3,4. La distribución celular del colesterol está determinada por su afinidad por los esfingolípidos y su aversión a los fosfolípidos (PL) altamente insaturados5. Estas interacciones moleculares promueven la segregación de microdominios de membrana considerados cruciales para las funciones de muchas proteínas integrales y sus interacciones1. La reserva de colesterol del cerebro está separada de otras reservas de colesterol del cuerpo y tanto las neuronas como los astrocitos sintetizan colesterol en el cerebro6. Los astrocitos producen un exceso de colesterol y secretan la mayor parte del colesterol producido para que lo utilicen las neuronas7. El principal transportador de salida de colesterol en los astrocitos es el transportador A1 de casete de unión a ATP (ABCA1), que transfiere el colesterol celular y los PL a apolipoproteínas pobres en lípidos que transportan el colesterol8,9,10.

La homeostasis del colesterol está desregulada en muchos síndromes asociados con el trastorno del espectro autista (TEA), incluido el síndrome del X frágil (FXS)11. El FXS es el síndrome de discapacidad intelectual hereditario más común y la causa monogénica de TEA12. El FXS es causado por la ausencia de la ribonucleoproteína mensajera del X frágil (FMRP), que es esencial para la formación normal de sinapsis y la plasticidad13. El tratamiento con lovastatina, un inhibidor de la 3-hidroxi-3-metilglutarilcoenzima A (HMG-CoA) reductasa que regula el paso temprano irreversible y limitante de la biosíntesis del colesterol, amortigua la hiperexcitabilidad neuronal en el cerebro del modelo de ratón FXS, Fmr1 KO ratones, y rescata parte del fenotipo FXS de ratón14. El tratamiento breve temprano con lovastatina también previno los déficits de aprendizaje asociativo en ratas Fmr1 KO15, pero el colesterol no se midió en relación con las respuestas al tratamiento con lovastatina en los modelos FXS de roedores.

En el primer estudio abierto se descubrió que el tratamiento con lovastatina mejora las habilidades de la vida diaria y las subescalas de comunicación en personas con FXS16. Los efectos del tratamiento fueron menores, pero aún así visibles, particularmente cuando lovastatina se combinó con minociclina también en otro estudio piloto con 22 participantes17. Sin embargo, la lovastatina no mejoró la respuesta al tratamiento de la intervención del lenguaje implementada por los padres en un ensayo aleatorizado, doble ciego18, y no quedó claro si la lovastatina tiene menos efecto sobre los mecanismos relacionados con el habla que los mecanismos subyacentes a otros síntomas como la hiperactividad y la estereotipia en el FXS. . Además, las diferencias individuales en el FXS y el uso combinado de otros fármacos pueden influir en el resultado de los ensayos clínicos con lovastatina16. Los individuos con FXS tienen colesterol periférico y triacilglicerol (TAG) reducidos, y un perfil anormal de ácidos grasos (AG)19,20,21, lo que cuestiona la idoneidad del tratamiento con lovastatina. Se han demostrado alteraciones específicas de regiones cerebrales en el metabolismo del colesterol en un modelo de FXS en ratas mediante el uso de un ensayo colorimétrico enzimático de colesterol22. Además, la deficiencia de FMRP tiene un impacto en la homeostasis de los lípidos23 y la suplementación con ácidos grasos poliinsaturados n-3 (PUFA n-3) tiene efectos beneficiosos sobre el fenotipo conductual de los ratones Fmr1 KO24,25.

Dado el papel crucial de los astrocitos en el mantenimiento de la homeostasis del colesterol en el cerebro, investigamos el equilibrio del colesterol en los astrocitos FXS. Descubrimos que la expresión de ABCA1 se redujo en astrocitos deficientes en FMRP derivados de células madre pluripotentes inducidas por humanos (iPSC) generadas a partir de machos FXS y de la corteza de ratones Fmr1 KO. El aumento concomitante de los niveles de colesterol y desmosterol de los astrocitos se asoció con la reestructuración de la membrana que favoreció a las especies de PL poliinsaturadas a expensas de las especies de esfingomielina (SM) y fosfatidilcolina (PC) con un bajo grado de insaturación. También exploramos el papel del estado proinflamatorio de los astrocitos FXS en la expresión reducida de ABCA1 y observamos un perfil de secretoma de citocinas/quimiocinas desregulado y la reactividad de los astrocitos FXS en respuesta a las citocinas. Sugerimos que las condiciones preinflamatorias y la homeostasis alterada del colesterol pueden impedir que los astrocitos del FXS afecten las interacciones neuroglia-neuronales en el FXS.

ABCA1 transfiere colesterol celular y PL a apolipoproteínas pobres en lípidos que transportan el colesterol esterificado9,10. Encontramos que la expresión del ARNm de ABCA1 se redujo (P = 0,011) en los astrocitos del cerebro anterior humano generados a partir de tres líneas iPSC masculinas específicas de pacientes con FXS en comparación con los controles (Fig. 1a). De manera similar, los astrocitos KO FMR1 derivados de células madre embrionarias humanas (hESC) expresaron menos ABCA1 que sus controles isogénicos (cambio log2 de -6,41 veces, P = 0,0004, ajuste de P = 0,125) en el análisis de RNA-Seq26. La expresión de la proteína ABCA1 también se redujo en cultivos de astrocitos derivados de FXS iPSC (P = 0,013; Fig. 1b, c).

a Expresión de ARNm de ABCA1 en control humano y astrocitos FXS; n(Control) = 3 líneas celulares y n(FXS) = 4 líneas celulares (3 líneas celulares biológicamente independientes). b Imágenes de inmunofluorescencia que muestran ABCA1 (rojo) y GFAP (verde) en control y astrocitos FXS, barra de escala de 50 μm. c Expresión relativa de la proteína ABCA1 en control y astrocitos FXS; n(Control) = 241 células y n(FXS) = 285 células en 3–4 cultivos/cada línea celular (4 líneas celulares de control y 3 FXS). d Abundancia relativa de colesterol total en medio condicionado por astrocitos (ACM) de control (líneas celulares HEL23.3, HEL24.3 y HEL46.11 de izquierda a derecha, respectivamente) y FXS (HEL69.6, HEL70.3, HEL70 .6 y líneas celulares HEL100.2 de izquierda a derecha, respectivamente) astrocitos en condiciones basales y después del tratamiento con ácido retinoico (RA). e Abundancia relativa de colesterol y ésteres de colesterol f en control y FXS ACM en análisis de lipidómica basado en LS-MS; n(Control) = 3 líneas celulares y n(FXS) = 4 (3 líneas celulares biológicamente independientes). La línea discontinua muestra los niveles de colesterol (e) y éster de colesterilo (f) en medio libre de células. g Relación de abundancia relativa de colesterol/éster de colesterol en control y FXS ACM en condiciones basales. h Expresión de FAT1P en control humano y astrocitos FXS; n(Control) = 3 líneas celulares y n(FXS) = 4 (3 líneas celulares biológicamente independientes). Los datos se muestran como media ± SEM. Se aplicó la prueba t bilateral para evaluar las diferencias estadísticas; *P<0,05.

Los astrocitos producen colesterol a demanda de las neuronas y secretan la mayor parte de su colesterol7. Para evaluar el impacto de la expresión reducida del transportador de colesterol astrocítico en la secreción de colesterol de los astrocitos FXS, comparamos el contenido de colesterol total en medio acondicionado de astrocitos (ACM) recolectado de cultivos de astrocitos humanos sin suero derivados de cuatro líneas FXS y tres iPSC de control. Observamos que el contenido de colesterol no difirió entre FXS y ACM de control (Fig. 1d). La exposición al ácido retinoico (RA), que puede aumentar la secreción de colesterol mediante la activación de la señalización del receptor X del hígado (LXR) -ABCA1, no afectó de manera mensurable los niveles de colesterol extracelular en FXS ni controló los cultivos de astrocitos (Fig. 1d).

Utilizando espectrometría de masas (MS), encontramos que los niveles de colesterol no eran significativamente diferentes entre FXS y ACM de control (P = 0,093), aunque hubo una tendencia que sugería un aumento (Fig. 1e). Existe evidencia de que los astrocitos humanos secretan grandes lipoproteínas ricas en colesterol y la mayor parte del colesterol secretado está esterificado (éster de colesterol, CE), a diferencia del colesterol principalmente no esterificado que contiene lipoproteínas secretadas por astrocitos de ratón27. Las cantidades de CE no difirieron entre FXS humano y las muestras de control en condiciones basales o después del tratamiento con RA (P = 0,409 y 0,945, respectivamente; Fig. 1f). Sin embargo, la proporción de colesterol a CE fue mayor en los secretomas de FXS que en los controles (P = 0,029; Fig. 1g).

Los CE almacenados y secretados se forman a partir de colesterol y acil-CoA28 graso de cadena larga. La proteína transportadora de AG FAT1P codificada por el gen SLC27A1 tiene actividad acil-CoA sintetasa y desempeña un papel crucial en la absorción de AG de cadena larga a través de la membrana plasmática29. De manera similar a la expresión de ABCA1, SLC27A1 se redujo en los astrocitos derivados de FXS iPSC (Fig. 1h) en comparación con los controles. La FATP1 regulada a la baja podría afectar el equilibrio de lípidos al reducir la absorción de AG de cadena larga en los astrocitos FXS.

La especificidad de FXS de la expresión reducida de ABCA1 en el modelo de astrocitos FXS del prosencéfalo humano se confirmó mediante la observación de una inmunorreactividad ABCA1 reducida en astrocitos corticales de ratones Fmr1 KO en comparación con los controles de tipo salvaje (WT) (P = 0,034; Fig. 2a). Al igual que en la ACM humana, los niveles de colesterol (P = 0,634; Fig. 2b) y CE (P = 0,202; Fig. 2c) no difirieron en la ACM de los astrocitos Fmr1 KO en comparación con WT, usando MS. Inesperadamente, se observó una disminución sustancial del desmosterol (367,3357 m/z; P = 0,030) (Fig. 2d), el último precursor del colesterol en la vía de la cadena lateral de esteroles insaturados de Bloch30, en el modo de iones positivos en Fmr1 KO ACM en comparación a eso en WT ACM.

a Inmunorreactividad relativa ABCA1 en astrocitos WT y Fmr1 KO de ratón cultivados. Los datos son media ± SEM; n = 48–57 imágenes, 4–5 cultivos de astrocitos por grupo aislado de compañeros de camada P1 WT y KO. b Abundancia relativa de colesterol, c abundancia relativa de éster de colesterol y d abundancia relativa de desmosterol en medio condicionado de astrocitos de ratón (ACM) WT y Fmr1 KO en análisis de lipidómica basado en LS-MS. e Mapa de calor (datos mostrados como puntuaciones z) que muestra el perfil de especies de fosfatidilcolina (PC) en WT y Fmr1 KO ACM en análisis LC-MS. f Gráfico de barras de los perfiles de especies de PC que también indica los valores de muestras individuales y g Gráfico de puntuaciones del análisis de componentes principales (PCA) de las especies de PC en WT y Fmr1 KO ACM. b – g Datos de ACM de ratón; media ± SEM, n(WT) = 3 y n(Fmr1 KO) = 3 cultivos de astrocitos biológicamente independientes. Se aplicó la prueba t para evaluar las diferencias estadísticas; *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001. El modelado independiente suave de analogías de clases (SIMCA) confirmó diferencias estadísticamente significativas en la composición de especies de PC en las muestras de medio WT y Fmr1 KO (P <0,05).

Además del colesterol, ABCA1 exporta PC, fosfatidilserina (PS) y SM desde la valva citoplasmática a la exocitoplásmica de las membranas, y su actividad ATPasa es particularmente estimulada por PC, PS y SM31. Descubrimos que los perfiles de lípidos eran diferentes entre ACM de Fmr1 KO y astrocitos de ratón WT y que las diferencias parecían ser más pronunciadas en los perfiles de las especies de PC (Fig. 2e). Los niveles de especies de PC monoinsaturadas (p. ej., 32:1 y 34:1) fueron más bajos y hubo ligeras elevaciones de especies de PC poliinsaturadas en Fmr1 KO ACM en comparación con los controles (Fig. 2f, Figura 1 complementaria). Estas diferencias de PC también fueron evidentes en el análisis de PCA (Fig. 2g). El perfil de PC alterado de Fmr1 KO ACM sugirió que la ausencia de FMRP condujo a una desregulación del flujo de salida de PC mediado por ABCA1 junto con el colesterol de los astrocitos de Fmr1 KO.

Descubrimos que la reducción de ABCA1 se asocia con varios cambios en el lipidoma de los astrocitos Fmr1 KO en el análisis de espectrometría de masas. La abundancia de colesterol aumentó en los astrocitos Fmr1 KO en comparación con los controles WT (P = 0,038; Fig. 3a). Dado que el colesterol total en el medio de astrocitos humanos y de ratón no se vio afectado por la deficiencia de FMRP, los datos sugirieron una acumulación de colesterol en los astrocitos. Sin embargo, el aumento de desmosterol en los astrocitos KO (P = 0,036; Fig. 3b) concomitante con la reducción de la abundancia de desmosterol en ACM sugirió una mayor absorción de desmosterol por parte de los astrocitos de ratón Fmr1 KO en el medio que contiene suero. Como el desmosterol es un precursor necesario para la síntesis de colesterol, los datos probablemente reflejaron una mayor síntesis de colesterol por parte de los astrocitos de ratón Fmr1 KO. La acumulación de desmosterol también podría considerarse como un intento de activar la señalización de LXR y, por tanto, aumentar la secreción de esteroles de los astrocitos32,33.

a Abundancia relativa de colesterol y b desmosterol en astrocitos de ratón WT y Fmr1 KO. c Gráfico de puntuaciones del análisis de componentes principales (PCA) de especies de fosfolípidos de membrana en astrocitos de ratón WT y Fmr1 KO. d Mapa de calor de los lípidos de membrana (datos mostrados como puntuaciones z) que muestra niveles elevados de especies de fosfolípidos poliinsaturados y también algunas especies con las cadenas más cortas, pero pobres en fosfolípidos que albergan una o dos cadenas de acilo monoinsaturadas en controles WT y astrocitos Fmr1 KO. e Perfiles de especies de fosfatidilcolina (PC) en astrocitos WT y Fmr1 KO, que también indican los valores para muestras individuales. f Gráfico de volcán de las especies de fosfolípidos de membrana que estaban hacia abajo (azul) o hacia arriba (rojo) en Fmr1 KO en comparación con los astrocitos WT. g Relación de lípidos "ácidos" de membrana fosfatidilserina (PS) y fosfatidilinositol (PI) en astrocitos WT y Fmr1 KO. h Biplot PCA de especies de fosfatidilserina (PS) y fosfatidilinositol (PI) en astrocitos WT y Fmr1 KO. Todos los datos se generaron en análisis de lipidómica LC-MS; n(WT) = 3 y n(Fmr1 KO) = 3 cultivos de astrocitos biológicamente independientes. Los datos se muestran como media ± SEM. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001. El modelado independiente suave de analogías de clase (SIMCA) confirmó que las muestras de astrocitos WT y Fmr1 KO tenían composiciones de especies de fosfolípidos, especies de PC y especies de fosfolípidos ácidos (PS y PI) estadísticamente significativas (P <0,05).

Además, encontramos que los perfiles de las especies de PL de membrana en los astrocitos Fmr1 KO y WT eran diferentes (Fig. 3c). La comparación de la composición de especies PL de los astrocitos Fmr1 KO y WT mediante espectrometría de masas reveló que los astrocitos KO tenían niveles aumentados de especies poliinsaturadas de PC, fosfatidiletanolamina (PE) y fosfatidilserina (PS) y algunas especies con las cadenas más cortas, y contenían menos PC y SM que alberga una o dos cadenas de acilo monoinsaturadas (Fig. 3d-f). El perfil de especies de PC también fue significativamente diferente entre los astrocitos WT y KO (Fig. 3e). De acuerdo con los hallazgos lipidómicos en la MCA, las especies poliinsaturadas mostraron niveles más altos en los astrocitos KO, lo que probablemente afectó la vesiculación, la fluidez de la membrana y la señalización del mediador derivado de lípidos que está involucrado en una variedad de procesos biológicos en conjunto con las citocinas. Si bien la cantidad total de especies de PS aumentó en las células KO, los niveles de SM disminuyeron (Fig. 3f). Los niveles de fosfatidilinositol (PI) se mantuvieron constantes y la relación PS/PI fue mayor en los astrocitos KO que en los astrocitos WT (Fig. 3g, h). Nuestros hallazgos sugirieron una acumulación de colesterol y un aumento de PL de membrana poliinsaturadas en los astrocitos Fmr1 KO.

Dado que la actividad ABCA1 está implicada en la neuroinflamación y los factores inflamatorios están involucrados en la regulación de su expresión34, exploramos mecanismos proinflamatorios que podrían contribuir a la reducción de la expresión de ABCA1 y a la alteración de la homeostasis del colesterol en los astrocitos FXS. Utilizando una matriz de anticuerpos contra citocinas comercial, encontramos que varias citocinas antiinflamatorias se redujeron en la ACM de los astrocitos FXS humanos. La interleucina-13 (IL-13) y la IL-10 fueron las citoquinas más reducidas en los astrocitos FXS en comparación con los controles (Fig. 4a). Dado que existe evidencia de que la IL-13 estimula la expresión de ABCA135, su bajo nivel (54,3% del control) podría contribuir a la reducción de la expresión de ABCA1 en los astrocitos FXS. Por otro lado, la IL-10 reducida (54,3% del control) puede ser consecuencia de la baja expresión de ABCA136. Por el contrario, no encontramos diferencias claras similares en las citocinas proinflamatorias IL-1α, IL-1β, IL-6, IL-8 y TNF-α entre el secretoma del control y los astrocitos FXS (Fig. 4a). De los ligandos de quimiocina CC en la matriz, la expresión de CCL1 fue anormalmente baja (36,2% del control) en FXS ACM en comparación con los controles en experimentos repetidos (Fig. 4a). CCL1 desencadena la quimiotaxis de Th2 y un subconjunto de células T reguladoras37, y se ha demostrado que su función inmunomoduladora está regulada por las estatinas38. RANTES (CCL5) se identificó previamente entre quimiocinas reducidas en plasma de individuos con FXS39, pero su nivel extracelular (95,4% del control) (Fig. 4a) o expresión de ARNm celular (P = 0,688) no fue diferente entre FXS y los astrocitos de control en condiciones basales. condiciones (Fig. 4b). Sin embargo, la expresión de CCL5 fue seis veces mayor (P < 0,0001) en los astrocitos FXS activados con IL-1β (10 ng/ml) y 2 veces menor (P < 0,0001) después del tratamiento con TNF-α (50 ng/ml). ) en comparación con los controles (Fig. 4c), lo que indica anomalías en las respuestas a las citocinas proinflamatorias40 en los astrocitos FXS. De manera análoga, el tratamiento con IL-1β resultó en un aumento de seis veces (P <0,0001) en la expresión de GFAP, mientras que el tratamiento con TNF-α disminuyó (dos veces) la expresión de GFAP en los astrocitos FXS en comparación con los controles (Fig. 4d).

a Comparación del perfil de citocinas y quimiocinas en la detección de astrocitos del prosencéfalo humano derivados de FXS y iPSC humanas de control. Los valores son porcentajes para FXS, calculados frente al control en cuatro controles agrupados y cuatro ACM derivados de FXS iPSC. b Expresión de ARNm de CCL5 en control y astrocitos FXS utilizando la expresión de GAPDH para la normalización. n(Control) = 3 y n(FXS) = 3 líneas celulares que representan variantes biológicas. c Expresión de ARNm de CCL5 y d GFAP en el control y astrocitos FXS en relación con los controles no tratados después del tratamiento con IL-1β y TNF-α. Se generaron astrocitos a partir de líneas de iPSC humanas control (HEL11.4) y FXS (HEL69.5) y se trataron con IL-1β (10 ng/ml) y TNF-α (50 ng/ml) durante 7 días. Los niveles de ARNm se analizaron mediante RT-qPCR con tres réplicas técnicas utilizando el método ΔΔCt. Los datos son media ± SEM. ***P < 0,001 mediante ANOVA de dos vías.

El cerebro contiene ~25% del colesterol total del cuerpo7. Los astrocitos constituyen la mayor población de células implicadas en la regulación de la homeostasis del colesterol, que es fundamental para el cerebro en desarrollo. Tanto los astrocitos como las neuronas sintetizan colesterol en el cerebro en desarrollo, pero a diferencia de las neuronas, los astrocitos normalmente no acumulan colesterol y secretan la mayor parte del colesterol recién sintetizado7. El equilibrio entre la secreción de colesterol y la retención celular está estrechamente regulado para evitar efectos tóxicos indeseables del exceso de colesterol en el espacio extracelular41. La toxicidad inducida por el colesterol se ha identificado como un factor crítico en la patogénesis de varias enfermedades, lo que ha despertado el interés en el uso terapéutico de medicamentos para reducir el colesterol14,15,16,17,18,41. En el presente estudio, se estudiaron los efectos de la ausencia de FMRP sobre el equilibrio del colesterol astrocítico de forma dependiente del tipo de célula en astrocitos FXS humanos y de ratón. Demostramos que la homeostasis del colesterol desregulada en los astrocitos FXS se manifestaba como una disminución de la expresión del transportador de colesterol ABCA1 tanto en astrocitos humanos como de ratón. En los astrocitos FXS humanos, el defecto ABCA1 se asoció con cambios en la secreción de citocinas, mientras que en los astrocitos KO Fmr1 de ratón cultivados con suero, el defecto ABCA1 provocó una acumulación de colesterol y desmosterol relacionada con cambios en las propiedades inflamatorias y el lipidoma (Fig. 5).

Los estudios de astrocitos FXS del prosencéfalo humano revelaron una expresión reducida de ABCA1 y del transportador de ácidos grasos (FA) FAT1P, que se asocia con un aumento en la proporción de colesterol/éster de colesterol en el medio condicionado por astrocitos (ACM). Los niveles de IL-13 e IL-10 implicados en la regulación de la expresión de ABCA1 se redujeron en la ACM de los astrocitos FXS humanos. La proteína ABCA1 reducida en los astrocitos Fmr1 KO se combinó con un aumento de colesterol y desmosterol, mientras que el desmosterol disminuyó en Fmr1 KO ACM, lo que sugiere una señalización alterada de LXR/RXR que contribuyó al mayor contenido de ácidos grasos poliinsaturados (PUFA) en los astrocitos FXS. Los cambios observados en los astrocitos FXS humanos y Fmr1 KO de ratón se muestran en rojo y azul, respectivamente.

ABCA1 es una proteína transmembrana que desempeña una función crucial en la regulación del equilibrio del colesterol al mediar la salida de colesterol libre intracelular y PL a través de la membrana plasmática10. Los astrocitos producen colesterol a demanda de las neuronas y ABCA1 es el principal transportador de salida de colesterol en los astrocitos10,31. Para evitar la toxicidad del colesterol, es necesario controlar cuidadosamente su contenido. Descubrimos que el contenido de colesterol extracelular se mantuvo normalmente en cultivos de astrocitos FXS humanos y de ratón que expresaban niveles reducidos de ABCA1. La disminución de ABCA1 condujo a la acumulación de colesterol astrocítico, lo que sugiere la activación de un eflujo no mediado por ABCA1 o un aumento de la difusión, tal vez debido a un mayor gradiente de colesterol entre las lipoproteínas medias y la membrana plasmática celular42.

El nivel de PC celular y la composición de especies afectan la distribución intracelular, el transporte y la secreción de colesterol mediada por ABCA128. El perfil de especies de PC fue diferente entre el control y los astrocitos KO Fmr1, y las especies de PC poliinsaturadas estaban elevadas tanto en Fmr1 KO ACM como en lisados de astrocitos KO en comparación con los controles. La PC es la clase de PL más abundante en las células eucariotas y, por lo tanto, sirve como un sumidero de colesterol que protege a las células contra el estrés del RE inducido por el colesterol43. La PC también sirve como precursora en la síntesis de SM necesaria para los nanodominios de membrana enriquecidos con SM y colesterol. En los astrocitos KO, el perfil PL de la membrana favorecía a las especies PC altamente insaturadas y contenía menos SM, lo que hacía que la membrana fuera estructuralmente incompatible con el colesterol44. Por lo tanto, la capacidad de las membranas de los astrocitos KO para amortiguar la sobrecarga de colesterol y prevenir la toxicidad del colesterol se vio comprometida.

Los altos niveles de especies de PL poliinsaturados en los astrocitos KO probablemente tuvieron varias consecuencias. La alta insaturación de PL puede modificar las propiedades físicas de la membrana y aumentar la liberación de vesículas que contienen CE y TAG desde el ER45,46. Además, la mayor disponibilidad del ligando PUFA para el receptor nuclear LXR altera la expresión génica mediada por LXR47. Se sabe que los ligandos del receptor LXR/retinoico X (RXR) estimulan la expresión de ABCA1 y la reducción de ABCA1 en los astrocitos FXS puede reflejar una señalización defectuosa de LXR/RXR potencialmente causada por RXRA y RXRB desregulados por la ausencia de FMRP48. Los astrocitos Fmr1 KO también mostraron niveles anormalmente altos de desmosterol, que es el segundo esterol más abundante en el cerebro y está implicado en la regulación de la plasticidad sináptica30. Tiene importantes funciones de señalización y, como agonista de LXR, inhibe los genes diana de SREBP y reprograma selectivamente el metabolismo de los ácidos grasos de una manera específica para el tipo de célula49,50. Dado que el desmosterol altera el empaquetamiento de lípidos de la membrana en comparación con el colesterol, podría contribuir al control de la fluidez de la membrana en células con exceso de colesterol51.

Además de los efectos mediados por LXR, el desmosterol puede tener efectos oxidativos e inflamatorios independientes de LXR49, mientras que los AGPI funcionan como precursores de diferentes mediadores lipídicos necesarios para controlar la inflamación52. Observamos que las citocinas antiinflamatorias secretadas eran bajas en la ACM FXS humana. En particular, los niveles de interleucinas relacionadas con la regulación de la expresión ABCA1 y la homeostasis del colesterol eran bajos. Es posible que los niveles bajos de IL-13 contribuyeran a la expresión reducida de ABCA1 en los astrocitos FXS35. Respectivamente, la baja expresión de ABCA1 podría haber estado implicada en la reducción de IL-10 en FXS ACM36. También se ha descrito un déficit de IL-10 en el hipocampo Fmr1 KO24. Las respuestas inmunes deterioradas en los astrocitos FXS son consistentes con la desregulación encontrada previamente de varias citocinas proinflamatorias en ratones Fmr1 KO24 y en estudios clínicos de FXS39,53. La respuesta inflamatoria astrocítica anormal de IL-6 se ha asociado con disfunción sináptica en ratones Fmr1 KO54.

Nuestro hallazgo de que los astrocitos Fmr1 KO tenían un alto contenido de PS y cantidades relativas bajas de especies SM saturadas y monoinsaturadas es especialmente interesante. La serina es el precursor común para la síntesis de PS y SM y, por lo tanto, en los astrocitos KO la síntesis de lípidos probablemente favoreció las vías que producen PS en lugar de SM. El PS de membrana alto activa muchas quinasas unidas a la membrana, que se han estudiado como objetivos de terapia en FXS55. Además, una proporción elevada de PS a SM, como en los astrocitos KO, activa la proteína quinasa C mediante cooperatividad positiva56. La activación de la proteína quinasa C promueve la estabilización inducida por apoA-I de la proteína ABCA157, regulada negativamente en los astrocitos KO. A pesar del aumento de PS en los astrocitos KO, los niveles de PI se mantuvieron constantes. Numerosas funciones de señalización utilizan PI fosforilados, que también participan en la regulación del transporte intracelular de colesterol en los sitios de contacto de la membrana, por ejemplo, entre el RE y el complejo de Golgi58. Aparentemente, el abundante precursor de PI apoyó dicho transporte en los astrocitos FXS.

El tratamiento con estatinas podría mejorar los resultados conductuales en niños con FXS16,17 y la lovastatina tiene efectos beneficiosos sobre el fenotipo de los ratones Fmr1 KO14. El tratamiento con lovastatina previno la susceptibilidad a las convulsiones audiogénicas y la síntesis excesiva de proteínas del hipocampo en estos ratones. El tratamiento redujo la hiperexcitabilidad neuronal causada por la hipersensibilidad a la activación de mGluR5-ERK1/259. Sin embargo, dado que los inhibidores de la síntesis de proteínas no pudieron producir estos efectos y la respuesta no fue replicada por el tratamiento con simvastatina60, los mecanismos que confieren efectos beneficiosos mediados por lovastatina sobre el fenotipo FXS aún no están claros. Nuestro estudio demostró que la homeostasis alterada del colesterol en los astrocitos del FXS se asoció con cambios más amplios en el lipidoma y factores inflamatorios, que son potencialmente modulados directamente por las estatinas61. El estudio también sugirió que el aumento de PL de membrana poliinsaturada contribuye a alterar el metabolismo del colesterol de los astrocitos FXS. Los estudios clínicos han demostrado que los niveles de colesterol periférico se reducen en los hombres con FXS y el informe reciente de Abolghasemi et al. mostró un perfil de lípidos plasmáticos anormal que incluye disminución de PUFA n-6 y PUFA n-3 en FXS21. Entre los AGPI n-3, el ácido eicosapentaenoico (EPA, 20:5 n-3) y el ácido docosahexaenoico (DHA, 22:6 n-3) fueron los más reducidos. Además, la suplementación con PUFA n-3 de ratones Fmr1 KO desde el destete hasta la edad adulta rescata muchos síntomas de comportamiento y parámetros neuroinflamatorios24. Varios ensayos clínicos han demostrado efectos beneficiosos de la suplementación con AGPI n-3 en el TEA y el TDAH, pero no todos los resultados son consistentes y la proporción de EPA y DHA en los suplementos de AGPI n-3 y la ingesta dietética general de AG pueden afectar el resultado clínico62. 63,64,65. Por ejemplo, el exceso de EPA puede inhibir funcionalmente la salida de colesterol mediada por ABCA166. También hay evidencia de que EPA y DHA modulan diferencialmente la expresión de citoquinas67. La expresión de IL-10 en monocitos, que se encontró reducida en los astrocitos FXS, fue mayor cuando las células se suplementaron con EPA que con DHA. Se han informado posibles efectos perjudiciales de alterar la proporción óptima de EPA y DHA en las funciones cognitivas68.

Los lípidos desempeñan funciones fundamentales en la función de los astrocitos, incluido el metabolismo energético, el mantenimiento de las interacciones entre lípidos y proteínas de la membrana y la señalización entre células. El colesterol es un componente lipídico importante de la membrana plasmática de las células y es esencial en el mantenimiento de la fluidez, el espesor y la segregación de los dominios lipídicos necesarios para múltiples plataformas de señalización. El colesterol se localiza con SM y PC en las membranas plasmáticas y en la superficie de las partículas de lipoproteínas. El presente estudio demostró que la deficiencia de FMRP en astrocitos afecta el equilibrio de los lípidos de membrana, disminuyendo la proporción de especies PC y SM con un bajo grado de insaturación, que es estructuralmente compatible con el colesterol, y aumentando la proporción de especies poliinsaturadas PL, incompatibles. con el colesterol pero que tiene funciones de señalización cruciales. Además de inhibir la función ABCA1 en la salida de colesterol, la composición lipídica de la membrana sesgada interfiere potencialmente con las funciones de varios canales en la membrana directamente o alterando la rigidez de la bicapa y el desajuste hidrofóbico entre los dominios transmembrana y la bicapa lipídica69. Nuestros resultados, en primer lugar, resaltan el papel de ABCA1 en la regulación del colesterol en los astrocitos del FXS y alientan a realizar más estudios para explorar ABCA1, cuyo tratamiento puede proporcionar efectos beneficiosos en el FXS. En segundo lugar, los aumentos observados en PL poliinsaturados en los astrocitos Fmr1 KO indican la necesidad de realizar más estudios sobre la regulación del perfil de PL de la membrana para desarrollar tratamientos novedosos utilizando el modelo de astrocitos derivados de iPSC humanos.

Los astrocitos del prosencéfalo humano se generaron como se describió anteriormente70 a partir de FXS masculino (HEL69.6, HEL70.3, HEL70.6 y HEL100.2) y control (HEL23.3, HEL24.3, HEL46.11, PO2/UEF-3A, y PO4/UEF-3B) líneas iPSC71,72,73,74,75. Además, los astrocitos se diferenciaron de la línea masculina de hESC FMR1 KO que porta una mutación que causa FXS y de sus hESC de control isogénico (H1)76. Se obtuvo el consentimiento informado de todos los donantes de células utilizadas para la reprogramación. La investigación con células humanas fue aprobada por el Comité de Ética del Distrito Hospitalario de Helsinki y Uusimaa, Finlandia.

Brevemente, las células madre pluripotentes humanas (hPSC) se mantuvieron en placas recubiertas con Matrigel en medio Essential 8 (E8; Thermo Fisher Scientific Ltd., Vantaa, Finlandia). Para la diferenciación, se disociaron hPSC confluentes al 80% con ácido etilendiaminotetraacético 0,5 mM (EDTA; Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU.) y se sembraron en una placa de seis pocillos de baja adherencia en E8 con 20 ng/ml de factor de crecimiento de fibroblastos básico humano (bFGF2). ; Peprotech, condado de Somerset, Nueva Jersey, EE. UU.) e inhibidor de la quinasa Rho 20 µM (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.). Al día siguiente, el medio se cambió a medio de inducción neuronal [Medio Eagle modificado por Dulbecco avanzado (DMEM)/F12, 1 × N2, L-glutamina 2 mM, 1 × aminoácidos no esenciales (NEAA) y 1 × × penicilina-estreptomicina (PS) (todas de Thermo Fisher Scientific)] suplementadas con LDN-193189 0,1 µM (Stemgent), ciclopamina 1 µM (Sigma-Aldrich), SB-431542 10 µM (Sigma-Aldrich) y 0,5 µg/ ml de DKK1 (proteína 1 relacionada con Dickkopf; Peprotech). DMEM/F12 avanzado permite la reducción del suero gracias a la adición de etanolamina, glutatión, ácido ascórbico, insulina, transferrina, albúmina sérica bovina (BSA) rica en lípidos AlbuMAX™ II para cultivo celular y oligoelementos selenito de sodio, metavanadato de amonio y sulfato cúprico. y cloruro manganoso. A los 12 días in vitro (DIV), el medio se reemplazó por medio de inducción neuronal suplementado con 20 ng/ml de factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF; Peprotech), y a los 30 DIV por medio de neuroesfera (Advanced DMEM/F12, 1× B27 -RA, 1× L-glutamato, 1× NEAA, 1× penicilina-estreptomicina (PS) [todos de Thermo Fisher Scientific]) suplementados con 20 ng/ml de bFGF2 y 20 ng/ml de factor de crecimiento epidérmico (Peprotech). Se agregaron factores de crecimiento tres veces por semana y las esferas se disociaron aproximadamente una vez por semana manualmente. A 60 DIV, se disociaron las esferas y se sembraron los progenitores en placas de cultivo recubiertas de poliornitina/laminina (Sigma-Aldrich) en medio de neuroesfera suplementado con 20 ng/ml de factor neurotrófico ciliar (CNTF; Peprotech). Las células se pasaron con tripsina-EDTA (0,05%) (Thermo Fisher Scientific) aproximadamente una vez por semana y se sembraron a 20.000 células/cm2. Después de 75 DIV, las células habían adquirido morfología de astrocitos y se mantuvieron en placas de cultivo recubiertas con Matrigel. La ausencia de FMRP en astrocitos derivados de FXS iPSC se confirmó en nuestros estudios anteriores. Todos los cultivos celulares se analizaron periódicamente para comprobar que estaban libres de contaminación por micoplasma utilizando un kit de detección de micoplasma (MycoAlert, Lonza Group Ltd.)

Para la inmunotinción de astrocitos humanos, las células sembradas con 30.000 células/pocillo en cubreobjetos recubiertos con laminina/poli-L-ornitina (Sigma-Aldrich) en placas de 24 pocillos se fijaron con paraformaldehído al 4% durante 15 minutos a temperatura ambiente (RT) y se lavaron. cuatro veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS). La permeabilización de las células con 2 % de BSA, 5 % de sacarosa, 5 % de leche desnatada y 0,1 % de Triton X-100 en PBS durante 30 minutos fue seguida de una incubación con el anticuerpo primario durante la noche a 4 °C y con el anticuerpo secundario durante 3 h a temperatura ambiente. en PBS suplementado con 2% de BSA, 5% de sacarosa y 0,05% de Triton X-100. Los anticuerpos primarios fueron anti-GFAP de pollo (Abcam, ab#4674, 1:500) y anti-ABCA1 de ratón (Abcam, ab#18180, 1:500). Los anticuerpos secundarios fueron Alexa Fluor 488 anti-pollo y Alexa Fluor 647 anti-ratón (ambos de Invitrogen, 1:1000). Los núcleos se tiñeron con 4´6-diamino-2-fenilindol (DAPI; Sigma, D9542, 1:10000) y se montaron con Shandon Immuno-Mount (Thermo Scientific).

Las células teñidas se escanearon en el escáner Pannoramic 250 (Flash III) (3D Histech, Budapest, Hungría) con objetivo 20X (NA 0,8) y cámara sMOS PCO.edge 5,5 de 2MP. Las imágenes fueron analizadas utilizando ImageJ. El umbral de intensidad se estableció en 10/255 para diferenciar las células del fondo. Se utilizó una herramienta de análisis de partículas automatizada para calcular el área y la intensidad media en cada celda de la imagen. El umbral de área se estableció en más de 500 píxeles. La intensidad intracelular media se determinó y se corrigió restando la intensidad de fondo.

Se utilizaron ratones macho Fmr1 KO y de tipo salvaje en un entorno congénico C57BL/6 (The Jackson Laboratory) en el día 1 posnatal (P1). Todos los estudios se realizaron de acuerdo con las pautas de los Institutos Nacionales de Salud y el Comité Institucional de Uso y Cuidado de Animales de la Universidad de California Riverside. Los ratones se mantuvieron en una instalación acreditada por la Asociación Estadounidense para la Acreditación del Cuidado de Animales de Laboratorio (AAALAC) bajo un ciclo estándar de luz/oscuridad de 12 h y se les dio acceso ad libitum a alimentos y agua.

Se prepararon cultivos primarios de astrocitos corticales a partir de las neocortezas de P1 Fmr1 KO y ratones de tipo salvaje como se describió anteriormente77. Los ratones se anestesiaron brevemente enfriándolos sobre hielo y se limpiaron con etanol. Los cerebros se diseccionaron y se colocaron en PBS helado suplementado con glucosa 25 mM y albúmina sérica bovina (PGB) al 0,1%. Se diseccionaron las cortezas y se extirparon las meninges. El tejido cerebral se incubó en papaína (0,5 mg/ml) -ADNasa (10 µl/ml) PGB a 37 °C durante 20 minutos. Los trozos de tejido se recogieron mediante centrifugación durante 5 minutos a 300 x g y se trituraron suavemente. Las células se sembraron en matraces de cultivo de tejidos T25 preparados recubriendo durante 1 a 2 h a 37 °C con 50 μg/ml de poli-d-lisina a una concentración de ~0,5 x 106 células/ml en DMEM suplementado con suero bovino fetal al 10% ( FBS) y 1 × PS (todos de Thermo Fisher Scientific). Los astrocitos se cultivaron en una incubadora humidificada con CO2 al 10% durante 1 semana hasta la confluencia y la microglía adherente se eliminó agitando a 180 rpm durante 2 h y 240 rpm durante 30 min, seguido de un cambio de medio. Las células se separaron utilizando tripsina-EDTA (0,05%) (Thermo Fisher Scientific) y se sembraron en placas con una densidad de 1 x 106 células en matraces T25 recubiertos. El medio de cultivo de astrocitos fue DMEM suplementado con FBS al 10 % y PS 1 × (todos de Thermo Fisher Scientific) y el medio se cambió cada 2 a 3 días. Se utilizaron astrocitos de ratón para experimentos de lipidómica de cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MC) a 24 DIV.

Para la inmunotinción, los astrocitos de ratón se colocaron en cubreobjetos de vidrio recubiertos con poli-d-lisina a una densidad de 5 x 104 células en placas de 24 pocillos. Después de dos días a 25 días in vitro (DIV), los astrocitos se fijaron con paraformaldehído al 2% durante 30 minutos a temperatura ambiente y se lavaron tres veces con PBS. Las células se permeabilizaron con Triton X-100 al 0,1% en PBS durante 30 minutos y se bloquearon con suero de burro normal al 1% durante 1 hora a temperatura ambiente. Las células se incubaron con anticuerpo primario en PBS suplementado con BSA al 2% y Triton X-100 (PBST) al 0,05% durante la noche a 4 ° C, se lavaron cuatro veces con PBST y luego se incubaron durante 2 h con anticuerpo secundario a temperatura ambiente. Los cubreobjetos de vidrio se montaron con medios de montaje Vectashield. Los anticuerpos primarios fueron anticuerpos anti-ABCA1 de ratón (1:500, Abcam, ab18180) y anti-GFAP de conejo (1:500, Cell Signaling Technology, 12389 T). Los anticuerpos secundarios fueron IgG anti-ratón de cabra conjugada con FITC (1:500, Invitrogen, 31569) y IgG anti-conejo de burro conjugada con AlexaFluor-594 (1:500, Invitrogen, AB150076).

Se tomaron imágenes confocales de astrocitos de ratón cultivados con un microscopio confocal de barrido láser SP5 (Leica Microsystems). Se capturaron secciones ópticas de alta resolución (formato de 1024 × 1024 píxeles) con un zoom de 20 × a intervalos de paso de 0,5 μm. Para el análisis ABCA1, se capturaron al menos 10 imágenes por cultivo (100 a 200 astrocitos) con 4 a 5 cultivos por grupo. En la Imagen J, cada pila z se contrajo en una sola imagen por proyección y se dividió por color. Las células que expresan GFAP se delinearon y guardaron en el administrador de ROI y se usaron para medir el área y la intensidad media de la inmunorreactividad ABCA1 en células que expresan GFAP y se corrigieron restando la intensidad de fondo. Se calculó la intensidad promedio de la inmunorreactividad ABCA1 para cada imagen (10 a 20 células).

Para la recolección de células ACM humanas se sembraron en matraces T25 recubiertos con Matrigel a una densidad de 20.000 células/cm2 y se cultivaron durante 7 días. El día anterior a la recolección de la muestra, el medio se reemplazó con 5 ml de medio de neuroesfera fresco. Como se indica, las células se trataron con ácido todo-trans retinoico (ATRA) durante 24 h. El medio recogido se filtró a través de un filtro de 0,22 µm y se almacenó a -80 °C hasta su uso. Se recogió ACM de ratón un día después de cambiar el medio a DMEM fresco suplementado con FBS al 10% y PS 1x. Las muestras se almacenaron a -80 °C hasta su uso.

La concentración de colesterol se determinó en ACM de FXS humano y astrocitos de control utilizando el kit de Cuantificación de colesterol (Sigma-Aldrich) y detección fluorométrica según las instrucciones del fabricante. Todas las muestras y estándares se procesaron por duplicado.

El perfil de citocinas en ACM se analizó utilizando Human Cytokine Antibody Array (Abcam, Cam-bridge, Reino Unido, Ab133998). Se preparó ACM colocando las células en matraces T25 recubiertos con Matrigel a una densidad de 20.000 células por cm2 y se cultivaron durante 7 días. El medio se reemplazó con 5 ml de NS fresco un día antes de recolectar las muestras, que se filtraron a través de un filtro de 0,22 µm y se almacenaron a -80 °C. Para el análisis, se combinaron medios de cuatro líneas de astrocitos derivados de iPSC y se realizó la matriz con medio sin diluir de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La detección quimioluminiscente se realizó con un sistema de imágenes ChemiDoc (Bio-Rad Finland, Helsinki, Finlandia) y los datos densitométricos se obtuvieron utilizando el software ImageJ. Se utilizaron intensidades medias de los puntos de control negativos y positivos para la corrección y normalización del fondo, respectivamente.

El análisis de lipidómica por cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS) se realizó en las instalaciones centrales de metabolómica de UC Riverside como se describió anteriormente78. Brevemente, el análisis se realizó en un espectrómetro de masas de tiempo de vuelo cuadrupolo Waters G2-XS acoplado a un sistema UPLC Waters Acquity clase I. Las separaciones se llevaron a cabo en una columna Waters CSH C18 (2,1 x 100 mm, 1,7 µM). Las fases móviles fueron (A) acetonitrilo: agua 60:40 con formiato de amonio 10 mM y ácido fórmico al 0,1% y (B) isopropanol:acetonitrilo 90:10 con formiato de amonio 10 mM y ácido fórmico al 0,1%. El caudal fue de 400 µl/min y la columna se mantuvo a 65 °C. El volumen de inyección fue de 2 µl. El gradiente fue el siguiente: 0 min, 10% B; 1 min, B al 10%; 3 min, B al 20%; 5 min, 40% B; 16 min, 80% B; 18 min, 99 % B; 20 minutos 99 % B; 20,5 min, 10 % B. El rango de exploración de MS fue (50–1600 m/z) con un tiempo de exploración de 100 ms. MS/MS se adquirió de forma dependiente de los datos. Las temperaturas de fuente y desolvatación fueron 150 °C y 600 °C, respectivamente. El gas de desolvatación se ajustó a 1100 l/h y el gas de cono a 150 l/h. Todos los gases eran nitrógeno excepto el gas de colisión, que era argón. El voltaje capilar fue de 1 kV en modo de ion positivo y de 2 kV en modo negativo. Se analizó periódicamente una muestra de control de calidad, generada mediante la combinación de alícuotas iguales de cada muestra, para monitorear la estabilidad y el rendimiento del sistema. Para la adquisición de datos se utilizaron 6 µl de volumen de inyección. Las muestras se analizaron en orden aleatorio. Se infundió leucina encefalina y se utilizó para la corrección masiva.

El procesamiento de datos no dirigido (selección de picos, alineación, deconvolución, integración, normalización y coincidencia espectral) se realizó en el software Progenesis Qi (Nonlinear Dynamics). Los datos se normalizaron para la abundancia total de iones de la muestra, la abundancia total de PL o la abundancia total de una clase de lípido específica. Se eliminaron las características con un CV >30 % en las inyecciones de control de calidad79,80. Para ayudar en la identificación de características que pertenecen al mismo metabolito, a las características se les asignó un ID de grupo utilizando RAMClust79,81. Se utilizó una extensión de las pautas de la iniciativa estándar de metabolómica para asignar confianza al nivel de anotación82,83. Los lípidos se identificaron de acuerdo con la coincidencia del tiempo de retención, los valores precisos de MS m/z y los espectros de MS/MS en comparación con una base de datos interna generada con estándares auténticos (p. ej., para desmosterol), la base de datos in-silico Lipidblast84 (p. ej., para diferentes especies de PL) o mediante el uso de bases de datos externas que incluyen varias bibliotecas de metabolitos de espectros de masas en Mass Bank of North America, Metlin85 (por ejemplo, para colesterol y especies de CE detectadas e identificadas por separado y resumidas hasta el total de CE).

El ARN celular total se extrajo utilizando el kit NucleoSpin RNA (QIAGEN) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se transcribió de forma inversa en ADNc complementario utilizando el kit de síntesis de ADNc iScriptTM (Bio-Rad, n.º 170-8891). Usando ADNc como plantilla, se realizó RT-qPCR con HOT FIREPol® EvaGreen® qPCR Mix Plus (Solis BioDyne) y LightCycler® 480 (Roche) durante 45 ciclos de 95 °C durante 15 s, 62 °C durante 20 s y 72 °C durante 20 s. Las expresiones genéticas se analizaron con el método ΔΔCt utilizando la expresión GAPDH para la normalización. Los experimentos se realizaron con tres réplicas técnicas. Los astrocitos se trataron con IL-1β (10 ng/ml) y TNF-α (50 ng/ml) durante 7 días como se indica. Los cebadores se muestran en la Tabla 1.

Los datos de secuenciación de ARN (RNA-seq) se generaron utilizando muestras por triplicado de células derivadas de hPSC isogénicas (control H1 y líneas celulares FMR1 KO) en la plataforma 95 DIV y NextSeq500. Las lecturas de secuenciación se filtraron según la calidad y la longitud y, después de retirar el adaptador, las lecturas se alinearon con el genoma humano utilizando Star Aligner (versión 2.5.0b) y se contaron con secuenciación de alto rendimiento. El análisis de expresión diferencial se realizó con el paquete R DESeq2. Se realizó una comparación de las tres muestras de D95 FXS con las dos muestras de control isogénicas para detectar genes cuya expresión difería significativamente.

Los datos se presentan como media ± SEM. Se utilizó la prueba t de Student para determinar las diferencias entre el control y los astrocitos FXS/Fmr1 KO, excepto para la expresión de CCL5 y GFAP en respuesta a citocinas, donde se realizó ANOVA utilizando SPSS Statistics 25 (IBM, Armonk, NY, EE. UU.). Las variables lipídicas en los grupos experimentales se demostraron mediante mapas de calor (usando distancias euclidianas y mostrando un máximo de 50 variables más significativamente diferentes mediante la prueba t), gráficos de volcán (usando un umbral de cambio de 1,3, un umbral de valor de P de 0,05 y una corrección de la tasa de descubrimiento falso). y gráfico de puntuaciones 2D del análisis de componentes principales con regiones de confianza del 95% o biplots (puntuaciones y cargas). Los análisis fueron realizados por MetaboAnalyst 5.0 (software gratuito de Xia Lab @ McGill). Se utilizó un modelado independiente suave de analogías de clases (SIMCA, una prueba cuantitativa que utiliza modelos de grupo basados en PCA)86 para probar si las diferencias entre las composiciones de especies de fosfolípidos de los grupos de muestras WT y Fmr1 KO eran estadísticamente significativas. SIMCA se realizó mediante el software Sirius V8.5 (Pattern Recognition Systems PRS, Bergen, Noruega). El valor de p <0,05 se consideró estadísticamente significativo.

Los experimentos que utilizaron astrocitos humanos se realizaron con células derivadas de al menos tres líneas diferentes de iPSC humanas FXS que representan réplicas y controles biológicos específicos del paciente, excepto los estudios de respuestas de citocinas en los que se realizaron tres cultivos separados de líneas celulares HEL11.4 de control y HEL69.5. usado. El perfil de quimiocinas y citocinas de FXS y astrocitos de control se mostró en muestras agrupadas. Utilizamos cultivos derivados de tres ratones Fmr1 KO y WT en análisis LC-MS y 4–5 cultivos de ambos grupos genéticos para estudios de expresión ABCA1.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Todos los datos que respaldan los hallazgos de este estudio están disponibles del autor correspondiente previa solicitud razonable. Los datos de RNA-seq están disponibles en la base de datos Gene Expression Omnibus con el número de acceso GSE228378. Los datos de origen para gráficos y tablas se pueden encontrar en los Datos complementarios.

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Descargar referencias

Agradecemos a Jari Koistinaho por las líneas iPSC humanas de control P02 y P04 y a Mahmoud Pouladi por las líneas isogénicas FMR1 KO y las líneas hESC H1 de control. También agradecemos la contribución inicial de Ulla-Kaisa Peteri al proyecto de investigación y los servicios brindados por la Unidad de Imágenes Biomedicum y el Laboratorio de Genómica, Secuenciación de ADN y Microscopía Digital FIMM en el Instituto de Biotecnología y la Unidad de Patología Molecular respaldada por la Universidad y el Biocentro de Helsinki. Finlandia y Metabolomics Core con el apoyo de la UCR. El trabajo fue apoyado por subvenciones de la Fundación de Investigación FRAXA (para MLC e IME), la Academia de Finlandia, la Fundación Arvo y Lea Ylppö y la Fundación Finlandesa para la Investigación Pediátrica. VAW cuenta con el apoyo de una beca TRANSCEND del Instituto de Medicina Regenerativa de California (Premio # EDUC4-12752). Acceso abierto financiado por la Biblioteca de la Universidad de Helsinki.

Departamento de Fisiología, Facultad de Medicina, Universidad de Helsinki, Helsinki, Finlandia

Karo Talvio, Rimante Minkeviciene & Maija L. Castrén

División de Ciencias Biomédicas y Programa de Posgrado en Neurociencia, Facultad de Medicina, Universidad de California Riverside, Riverside, CA, EE. UU.

Victoria A. Wagner, Anna O. Kulinich e Iryna M. Ethell

Centro Central de Metabolómica, Instituto de Biología Integrativa del Genoma, Universidad de California Riverside, Riverside, CA, EE. UU.

Jay S. Kirkwood, Anil Bhatia y Manhoi Hur

Tecnología genética y celular, Instituto AIVirtanen, Universidad del Este de Finlandia, Kuopio, Finlandia

Juzoh Umemori

Unidad de Lipidómica de la Universidad de Helsinki, HiLIPID, Instituto de Ciencias de la Vida de Helsinki, HiLIFE, Biocenter Finland (Metabolómica) y Programa de Investigación en Biociencias Moleculares e Integrativas, Facultad de Ciencias Biológicas y Ambientales, Universidad de Helsinki, Helsinki, Finlandia

Reijo Käkelä

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MLC e IME concibieron el proyecto. RK proporcionó información adicional y analizó datos de lípidos. VAW, AOK, RM, JU, IME y MLC realizaron experimentos y analizaron datos. JSK, AB y MH realizaron análisis de espectrometría de masas. KT analizó los datos y contribuyó a las ilustraciones y finalización del manuscrito. MLC y RK escribieron el manuscrito. Todos los autores discutieron los resultados y contribuyeron al manuscrito.

Correspondencia a Maija L. Castren.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Communications Biology agradece a los revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Editores primarios: Eliana Scemes y Joao Valente. Un archivo de revisión por pares está disponible.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

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Talvio, K., Wagner, VA, Minkeviciene, R. et al. Un modelo de astrocitos derivado de iPSC del síndrome de X frágil muestra una homeostasis del colesterol desregulada. Común Biol 6, 789 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-05147-9

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Recibido: 29 de septiembre de 2022

Aceptado: 14 de julio de 2023

Publicado: 29 de julio de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-05147-9

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