Un BG modificado

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 12840 (2023) Citar este artículo

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La detección temprana de patógenos en vectores es importante para prevenir la propagación de enfermedades arbovirales, proporcionando un indicador oportuno de la circulación de patógenos antes de que ocurran brotes. Sin embargo, la vigilancia entomológica puede enfrentar limitaciones logísticas, como el mantenimiento de la cadena de frío, y limitaciones de recursos, como la carga de trabajo de campo y laboratorio para el procesamiento de mosquitos. Proponemos un sistema de captura basado en tarjetas FTA que tiene como objetivo simplificar las fases tanto de campo como de laboratorio de la vigilancia de arbovirus. Modificamos una trampa BG-Sentinel para incluir una cámara de recolección de mosquitos y una fuente de alimentación de azúcar a través de una tarjeta FTA empapada en una solución viscosa de larga duración de miel e hidrogel de hidroxicelulosa. La tarjeta FTA garantiza la preservación ambiental de los ácidos nucleicos, lo que permite la recolección y alimentación continua de muestras durante varios días y reduce el esfuerzo requerido para la detección viral. Probamos el prototipo de trampa durante dos temporadas de campo (2019 y 2021) en el noreste de Italia y lo comparamos con la captura CDC-CO2 aplicada en la vigilancia regional del virus del Nilo Occidental y Usutu. Las colecciones realizadas mediante el enfoque BG-FTA detectaron una alta diversidad de especies, incluidas Culex pipiens, Aedes albopictus, Culex modestus, Anopheles maculipennis sensu lato y Ochlerotatus caspius. Cuando se usó para un muestreo de dos días, la trampa BG-FTA tuvo el mismo desempeño que CDC también para el vector principal del WNV, Cx. pipiens. Las tarjetas FTA detectaron tanto WNV como USUV, lo que confirma la confiabilidad de este novedoso enfoque para detectar la circulación viral en mosquitos infecciosos. Recomendamos este enfoque de vigilancia como una alternativa particularmente útil en la vigilancia de objetivos múltiples, para muestreo en áreas remotas y en contextos caracterizados por altas densidades y diversidad de mosquitos.

Los patógenos transmitidos por mosquitos se están propagando a nivel mundial debido a cambios en diversos factores, como las condiciones sociales, demográficas y ambientales, que afectan sus patrones de transmisión1. Esto puede dar lugar a la introducción de patógenos exóticos en nuevas áreas, así como a la reaparición o intensificación de la transmisión en entornos endémicos2.

En Europa, el aumento de casos autóctonos de enfermedades exóticas transmitidas por mosquitos pone de relieve la vulnerabilidad de esta región templada, como lo demuestran los brotes de dengue y chikungunya notificados en los últimos años3,4,5,6,7. Entre los patógenos endémicos, el virus del Nilo Occidental (VNO) está ampliamente presente en muchos países europeos8,9. El ciclo infeccioso es zoonótico e involucra a los mosquitos Culex pipiens como vector principal, a varias especies de aves como huéspedes reservorios y a los humanos y los caballos como huéspedes finales10. En 2018 y 2022, las dos temporadas de transmisión más importantes del VNO ocurrieron en el centro y sur de Europa. Italia fue el país más afectado, con 576 casos humanos en 2018 y 586 en 202211,12.

Otro Flavivirus que circula en el continente europeo es el Usutu (USUV), que pertenece al mismo serocomplejo del WNV. Fue detectada por primera vez en Europa en 1996 (Italia), y en los años siguientes se extendió por varios países europeos13,14. En la actualidad, se han notificado al menos 28 casos de infección por USUV en humanos15,16, y los dos primeros casos de infección neuroinvasiva en todo el mundo se describieron en 2009 en dos pacientes inmunocomprometidos en Italia14,17. En general, la información actual sugiere una posible importancia para la salud pública de este virus zoonótico18.

La epidemiología del WNV y USUV varía entre los países europeos debido a factores climáticos y ambientales, lo que lleva a diferentes estrategias de vigilancia. Sin embargo, los países europeos están adoptando cada vez más un enfoque integrado de Una Salud, que incluye vigilancia humana, veterinaria y/o entomológica19. Además del VNO, la Red Comunitaria de Vigilancia Epidemiológica incluye los virus chikungunya (CHIKV), dengue (DENV) y Zika (ZIKV) en su plan de vigilancia20. Esta decisión ha sido respaldada por la evidencia de cambios epidemiológicos en la distribución de arbovirus y la introducción de mosquitos vectores invasores2.

La detección temprana de patógenos en mosquitos vectores es crucial para prevenir brotes y tiene el potencial de proporcionar un indicador oportuno de la circulación de patógenos antes de propagarse a huéspedes vertebrados y, por lo tanto, a humanos21. Sin embargo, la vigilancia basada en mosquitos es costosa en términos de tiempo, coste y mano de obra, aunque mucho menor que el coste sanitario y el posible impacto económico de un brote22,23,24,25,26. La vigilancia basada en vectores implica recolectar especies objetivo y transportarlas a un laboratorio para el procesamiento de muestras y el análisis molecular. En la mayoría de los casos, se debe mantener la cadena de frío para preservar el ácido nucleico de la degradación, lo que complica la manipulación y el procesamiento de las muestras. Otra dificultad en la vigilancia de vectores es que la detección de patógenos en los grupos de mosquitos puede indicar muestras infectadas, pero no necesariamente infecciosas, que sólo pueden evaluarse mediante la detección de patógenos en la saliva.

Recientemente, varios estudios investigaron la explotación de la saliva o los excrementos de mosquitos en la vigilancia de vectores. Estos estudios, que adoptan diferentes sistemas de captura y esquemas de muestreo, se basan en la adición de sustratos sólidos que preservan los ácidos nucleicos (por ejemplo, la tarjeta Whatman FTA) para recolectar y preservar a temperatura ambiente los patógenos liberados por los mosquitos a través de la saliva durante la alimentación con azúcar o a través de sus excrementos durante la alimentación. cautiverio en la trampa27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41. De hecho, la detección de patógenos a partir de tarjetas FTA ofrece muchas ventajas en comparación con la detección de mosquitos en piscinas: ausencia de mantenimiento de la cadena de frío, reducción del esfuerzo laboral e identificación precisa de muestras infecciosas.

En este estudio, proponemos un enfoque de muestreo basado en una trampa centinela BG modificada equipada con un sistema de alimentación de azúcar con tarjeta FTA, destinado a aumentar la supervivencia de los mosquitos42. Probamos este enfoque durante dos años de muestreo (2019 y 2021) frente al muestreo estándar de vigilancia de arbovirus (trampa CDC-CO2) en un área endémica para los virus del Nilo Occidental y Usutu (región de Véneto, Italia), demostrando su eficacia en la detección de arbovirus.

La trampa utilizada en este estudio fue una BG-sentinel modificada (Biogents AG, Regensburg, Alemania, en adelante BG) equipada con un sistema de alimentación (Fig. 1) diseñado para mantener vivos a los mosquitos por más tiempo. Este sistema incluye: (i) una cámara de recolección que proporciona un ambiente más cómodo que la bolsa de malla original, reduciendo el estrés y la mortalidad de los mosquitos durante la actividad de la trampa; (ii) un sistema de tuberías que reduce el flujo de aire en la cámara, evitando la rápida deshidratación de los mosquitos; (iii) un sistema de entrega de azúcar (alimentador) de tarjeta FTA a través del cual los mosquitos recolectados pueden liberar patógenos durante la harina de azúcar. El comedero es un tubo de plástico (altura 6,5 ​​cm, Ø1,5 cm; Euroclone SpA, Italia) lleno de una solución a base de miel compuesta por 2% de hidroxietilcelulosa (Mw promedio 720000; Sigma-Aldrich, EE. UU.) en agua. y miel natural de Acacia (Biscotti P. Gentilini Srl, Italia) en proporción 3:2, en la que se empapa parcialmente una tarjeta FTA Classic (Whatman GE Healthcare, Reino Unido). La solución se tiñe con azul de metileno al 0,15% (un tinte de baja toxicidad para los mosquitos; Merck KGaA, Alemania) para permitir la identificación de mosquitos alimentados con azúcar. El comedero se probó preliminarmente en laboratorio en mosquitos Aedes albopictus para evaluar las tasas de alimentación de azúcar (Archivo complementario 1: Tabla S1).

Trampa BG-Sentinel modificada utilizada en este estudio. (A) Representación esquemática del dispositivo de captura. El sistema de alimentación comprende una cámara de recogida y un alimentador. La cámara de recogida es un recipiente de plástico insertado en una bolsa colectora, con una abertura superior y un sistema de tuberías. El sistema de tuberías consta de un tubo de entrada superior que atraviesa la tapa del contenedor y un tubo de flujo de aire en la parte inferior, cubierto con una malla fina. Un embudo de nailon negro cubre la abertura superior de la trampa y dirige a los mosquitos a través del tubo de entrada de la cámara de recolección; (B) Cámara de recolección; (C) Detalle del alimentador que muestra la tarjeta FTA parcialmente empapada en la solución teñida de azúcar.

Los muestreos de campo se llevaron a cabo en once municipios de la región del Véneto (noreste de Italia, Fig. 2): Badia Polesine, Ceneselli, Ficarolo, Minerbe, Villa Bartolomea, Nogarole Rocca, Oppeano, Erbè, Jesolo, Caorle. En 2021, se tomaron muestras de un solo sitio en Selvazzano Dentro. Todos los sitios se caracterizaron por una alta densidad de vectores y una circulación endémica de WNV y USUV, según lo informado a partir de datos históricos obtenidos entre 2010 y 2020 por el Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Venezie (IZSVe)43.

Mapa de los sitios de muestreo en la región del Véneto. Puntos 1 a 10: sitios muestreados durante 2019; punto 11: sitio de muestreo de 2021. Fuente de la imagen de fondo: OpenStreetMap. Imagen creada con el software QGIS (versión 3.28; Equipo de Desarrollo de QGIS; 2022; Sistema de Información Geográfica QGIS; Proyecto de Fundación Geoespacial de Código Abierto. https://qgis.org).

Durante el muestreo de 2019 se realizaron cuatro colectas en semanas alternas en diez sitios de julio a agosto, resultando en un total de 112 observaciones. Nuestro prototipo de trampa BG se comparó con una trampa tipo CDC (Italian Mosquito Trap; PeP, Cantu, Italia; en adelante CDC), que se eligió como comparador porque se considera un dispositivo altamente efectivo para el muestreo de Culex pipiens en Italia44 y es el trampa más utilizada en la vigilancia del VNO45. Ambas trampas recibieron 2 kg de hielo seco como fuente de CO2. Además, la trampa BG fue cebada con BG-Lure (Biogents). Las trampas se desplegaron aproximadamente a 50 m una de otra para evitar interferencias entre ellas. La trampa CDC se dejó activa durante aproximadamente 24 h, mientras que la trampa BG se dejó activa durante un día adicional, reemplazando el hielo seco y la batería en el momento de la recolección de mosquitos el primer día de muestreo. Debido a que las trampas CDC utilizadas para la vigilancia del VNO se colocan constantemente en el mismo lugar cada año, no fue factible rotar las posiciones de las trampas CDC y BG.

Para investigar el desempeño de la trampa BG durante varios días hábiles en relación con la prevalencia de la infección por mosquitos, en 2021, solo se probó un sitio (Selvazzano Dentro) (julio-agosto) siguiendo un diseño experimental diferente. Se dejaron operativas cinco trampas BG durante cuatro días consecutivos cada semana, mientras que se utilizó una única trampa CDC como control, que funcionó solo durante una noche, tras la configuración del muestreo de 2019. Durante los cuatro días de recolección de las trampas de BG, el CO2 fue suministrado continuamente por un cilindro de gas y el ventilador fue alimentado a través de una línea eléctrica. Los mosquitos se recogieron al final del cuarto día.

Los especímenes recolectados se identificaron morfológicamente de acuerdo con claves taxonómicas estándar46 y se dividieron en grupos de un máximo de 100 hembras, según la fecha de recolección, el sitio, el método de captura y la especie. En el primer año de muestreo (2019), también se evaluó la presencia de tinte azul en todos los mosquitos identificados para determinar la tasa de alimentación diaria de cada especie y predecir la presencia de saliva en la tarjeta FTA. Todos los mosquitos recolectados se identificaron manteniendo la cadena de frío y se almacenaron a -80 °C. Las tarjetas FTA se colocaron individualmente en tubos Eppendorf de 2 ml durante como máximo 7 días a temperatura ambiente hasta el siguiente análisis. Esta ventana de tiempo fue compatible con la detección del VNO según las pruebas preliminares realizadas en condiciones de semicampo (Archivo complementario 1: Tabla S2, Figuras S1 y S2) y evidencia de la literatura47. Para evitar la contaminación, todas las tarjetas se analizaron por separado de los mosquitos y en días diferentes, esterilizando todos los instrumentos de manipulación después de cada manipulación de la muestra.

El ARN viral de las tarjetas FTA se extrajo utilizando el kit QIAamp Viral RNA (QIAGEN, Valencia, CA, EE. UU.). El tampón AVL (tampón de lisis viral con ARN portador, QIAGEN), EtOH (ITW Reagents, Italia) y la cantidad de portador de ARN se aumentaron proporcionalmente para un volumen inicial de 200 µl (800 µl de tampón AVL, 8 µl de portador de ARN, 800 µl de EtOH). Las muestras se agitaron durante 2 h a temperatura ambiente después de la rehidratación con tampón AVL y luego se procedió a la extracción según el protocolo del fabricante. El ARN de los mosquitos agrupados se extrajo con un sistema automatizado de extracción de ácido nucleico para reducir el tiempo de intervención, aumentar el rendimiento de las muestras y reducir el riesgo de contaminación. Antes de la extracción, se agregaron dos perlas de carburo de tungsteno de 5 mm a cada grupo de mosquitos y las muestras se homogeneizaron con TissueLyser II (QIAGEN) a 30 Hz por 30'' durante dos rondas. El ARN se extrajo del homogeneizado con un extractor automático (Microlab STAR Hamilton, América, Australia y la Cuenca del Pacífico) utilizando el kit MagMAX Pathogen RNA/DNA (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) siguiendo el protocolo del fabricante de gran volumen.

El ARN extraído de mosquitos agrupados y tarjetas FTA se analizó para detectar la presencia de flavivirus mediante una RT-PCR, seguida de una PCR48 semianidada y secuenciación. Se realizó una RT-PCR basada en SYBR Green dirigida a 250 pb de la región conservada del gen NS5 no estructural en un volumen final de 20 µl que contenía 10 µl de 2X QuantiNova SYBR Green RT-PCR Master mix (QIAGEN) (concentración final 1X), 0,25 µl de mezcla QuantiNova RT, 5,15 µl de agua libre de RNasa, 1 µl de cebador directo MAMD 10 µM (concentración final, 0,5 µM), 0,6 µl de cebador inverso cFD2 10 µM (concentración final, 0,3 µM) y 3 µl de plantilla de ARN. El ciclo térmico de la PCR se realizó con el sistema de PCR en tiempo real StepOnePlus de Applied Biosystems (Thermo Fisher Scientific) para las muestras recolectadas en 2019 y con MIC (BMS, Resnova, RM, Italia) para las muestras de 2021, de la siguiente manera: incubación inicial de 10 min. a 50 °C y 2 min a 95 °C, amplificación de 45 ciclos a 95 °C durante 5 s y 30 s a 60 °C, disociación y fusión de 60 a 95 °C con una velocidad de rampa de 0,3 °C/s. Se realizó un análisis de la curva de fusión para determinar la presencia de ARN viral y la homogeneidad de los productos de la PCR.

Los resultados positivos se confirmaron con PCR heminested y secuenciación. La amplificación por PCR se realizó utilizando cebadores FS788 e CFD242 dirigidos a 220 pb del gen NS5 en un volumen final de 50 µl que contenía 5 µl de 10X Buffer II (AmpliTaq Gold DNA Polymerase with Buffer II y MgCl2, Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific) (concentración final 1X ), 4 µl de MgCl2 25 mM (concentración final 2,0 mM), 1 µl de dNTP 10 mM (concentración final 0,2 mM), 2,5 µl de 10 µM de cebador directo FS778 (concentración final 0,5 µM), 2,5 µl de 10 µM de Cebador inverso CFD2 (concentración final 0,5 µM), 5 U de AmpliTaq Gold (concentración final 2,5 U), 33,5 µl de H2O ultrapura pretratada con DEPC y 1 µl de ADNc.

Los ciclos térmicos de PCR utilizados para los cebadores cFD2 y FS 778 se realizaron de la siguiente manera: incubación de 10 min a 95 °C seguida de 25 ciclos de desnaturalización durante 30 s a 94 °C, hibridación a 54 °C durante 30 s, extensión a 72 °C. °C durante 30 s y extensión final a 72 °C durante 3 min.

Los productos de amplificación se identificaron por sus pesos moleculares mediante electroforesis en un gel de agarosa al 7% teñido con SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain 1X (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific) y se visualizaron bajo luz UV usando Gel Doc XR + Gel Documentation System (Bio-Rad , Hércules, California, EE.UU.). Los productos de PCR positivos se purificaron y secuenciaron en ambas direcciones utilizando los mismos cebadores directos e inversos de PCR heminested, empleando un analizador genético ABI PRISM 3130xl de 16 capilares (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE. UU.). Los datos de la secuencia se ensamblaron y editaron con el software SeqScape v2.5 (Applied Biosystems). Las secuencias obtenidas se alinearon y compararon con secuencias representativas disponibles en la base de datos GenBank utilizando la herramienta de búsqueda de alineación local básica (BLAST; //blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).

Se utilizaron diferentes modelos lineales generalizados (GLM) para investigar: (1) la relación entre la abundancia de mosquitos observada con el BG con la observada con la trampa CDC; (2) la variación de la diversidad de especies de mosquitos en relación con la trampa; (3) la tasa de infección por mosquitos según trampa y días laborables. Más específicamente:

(1) Para definir la abundancia de mosquitos recolectados por el BG en relación con la trampa CDC, probamos un modelo GLM con distribución binomial negativa (para superar la sobredispersión de datos). Se utilizó como variable de respuesta la abundancia de mosquitos el primer día de recolección. Se incluyeron como variables explicativas el tipo de trampa, el día juliano y los sitios de muestreo. Además, incluimos el tiempo de trabajo como un término de compensación, para tener en cuenta las diferencias en el esfuerzo de muestreo para cada colección. Este modelo se ejecutó para la abundancia total de mosquitos hembras y por separado por especie.

(2) Para investigar la diversidad de mosquitos, calculamos el índice de diversidad de Shannon (SH) como:

donde pi es la proporción de individuos de la iésima especie dividida por el número total de individuos encontrados en cada colección y S es el número de especie. Luego desarrollamos un GLM con distribución normal, con SH como variable de respuesta y como covariables las mismas covariables que usamos en el modelo 1.

(3) Para estimar la tasa de infección de mosquitos agrupados, calculamos la estimación de máxima probabilidad (MLE) para cada uno de los virus detectados, utilizando el enfoque desarrollado por los CDC (https://github.com/CDCgov/PooledInfRate). Estimamos el punto y el intervalo de confianza del MLE para cada año de muestreo y para cada virus detectado, con base en valores binarios de muestras agrupadas en relación con el método de trampa, el número de grupos analizados, el tamaño de los mosquitos analizados por grupo y el sitio (en caso de muestreo de 2019) o semana (en caso de muestreo de 2021). También estimamos el valor MLE para cada año en relación con las especies de mosquitos y la trampa, incluido el número de grupos analizados y el tamaño de los mosquitos analizados por grupo.

Todos los análisis se realizaron en el entorno estadístico R v.4.0.549, utilizando los siguientes paquetes: PooledInfRate50, mass51, performance52, visreg53, ggplot254, dplyr55 y reshape56.

En total, se recolectaron 40.944 (hembras: 98,6%, machos: 1,4%) especímenes de Culicidae durante el muestreo de 2019 (Fig. 3), mientras que durante el muestreo de 2021 se recolectaron 6.068 (hembras: 98,3%, machos: 1,7%) (en total, 98,4%). % de mosquitos identificados morfológicamente con éxito, BG: 99,9%, CDC: 96,6%).

Abundancia de mosquitos hembra recolectados en 2019 en sitios muestreados de la región del Véneto. Los datos se refieren a especies de mosquitos hembra recolectadas con ambos tipos de trampas. No se reportan especies raras (Aedes vexans, Culiseta annulata, Coquillettidia richiardii).

La trampa CDC recogió en promedio 2,16 veces más Cx. pipiens hembra que BG (intervalo de confianza del 95%: 1,568–2,941 hembras/trampa), pero 0,14 Ae. albopictus (IC del 95%: 0,083–0,222 f/t) y 0,45 An. maculipennis sl (IC del 95 %: 0,231–0,862 f/t) que las recolectadas con BG (Fig. 4). Además, las trampas BG y CDC mostraron desempeños similares en la captura de Oc. caspio y Cx. modesto. La abundancia de Cx. pipiens y Cx. modestus también se vio afectado por el día juliano, con una disminución significativa de la primera especie (0.96 f/t; IC 95% 0.946–0.965) y un aumento de la última (1.03 f/t; IC 95% 1.043–1.072). Durante 2019 se observaron diferencias en la abundancia de especies entre sitios. Entre las especies más abundantes, Cx. pipiens fue significativamente más abundante en Oppeano (2,25 f/t; IC 95% 1,115–4,541) y Minerbe (2,18f/t; IC 95% 1,076–4,395). Aedes albopictus fue significativamente más abundante en Oppeano (2,71 f/t; IC 95% 1,020–7,196), mientras que estuvo menos representado en Ceneselli (0,21 f/t; IC 95% 0,068–0,621), Nogarole Rocca (0,11 f/t ; IC 95% 0,032–0,361) y Villa Bartolomea (0,10 f/t; IC 95% 0,030–0,357). Ochlerotatus caspius fue significativamente menos abundante en Nogarole Rocca (0,11 f/t; IC 95% 0,036–0,331), Minerbe (0,01 f/t; IC 95% 0,001–0,033), Oppeano (0,32 f/t; IC 95% 0,109– 0,938) y Villa Bartolomea (0,10 f/t; IC del 95%: 0,033–0,304) (Archivo complementario 2).

Efectos del método de trampa (BG o CDC) sobre las hembras de mosquitos esperadas recolectadas por especie, como resultado de los Modelos Lineales Generalizados. Los datos se refieren únicamente a las especies de mosquitos hembra recolectadas el primer día de muestreo, cuando ambas trampas estaban operativas. No se reportan especies raras (Aedes vexans, Culiseta annulata, Coquillettidia richiardii).

Se observaron valores más altos de diversidad de especies en la colección de BG (SH: 0,73 IC del 95%: 0,618–0,852) en comparación con los CDC (SH: 0,40 IC del 95%: 0,317–0,488). La diversidad de mosquitos aumentó significativamente con las fechas de muestreo, mientras que se observaron diferencias significativas entre los sitios, con una menor diversidad de mosquitos en Ceneselli, Minerbe y Villa Bartolomea en comparación con otros sitios de muestreo (Archivo complementario 2).

Se observaron altas tasas de alimentación de azúcar en cada recolección (en general, mosquitos hembras; mediana: 80%; observación: 251; mosquitos: 20,018). Sin embargo, se observó cierta variabilidad en relación a las especies, con una frecuencia mediana del 76% en Ae. albopictus (obs.: 63; mezquita: 1304), 100% en Ae. vexans (obs.:9; mezquita: 37), 91% en An. maculipennis sl (obs.:29; mosq.: 470), 66% en Cx. modestus (obs.: 20; mosq: 197), 73% en Cx. pipiens (obs.: 69; mezquitas: 14.335), y 89% en Oc. caspio (obs.: 61; mezquita: 3675) (Fig. 5).

Tasas de alimentación con azúcar en tarjetas FTA para especies recolectadas con trampas BG. Los diagramas de caja muestran el valor mínimo (min), el primer cuartil (Q1), la mediana, el tercer cuartil (Q3) y el valor máximo (max) para Aedes albopictus, Aedes vexans, Anopheles maculipennis sl, Culex modestus, Culex pipiens y Ochlerotatus caspius.

Los grupos de mosquitos y las tarjetas FTA positivas para WNV y USUV se resumen en las Tablas 1 y 2. En 2019, cambiar el esfuerzo de muestreo de las trampas BG de 24 a 48 h resultó en un aumento de los grupos de mosquitos positivos para WNV y USUV, de 2 y 3 a 5 y 10, respectivamente (de 358 pools analizados). Con este esfuerzo de muestreo, la trampa BG logró la misma sensibilidad que la trampa CDC (5 grupos WNV-2, 10 grupos USUV, un total de 240 grupos) (Tabla 1). En 2021, en la colección BG, donde las trampas estuvieron activas durante cuatro días consecutivos, 4 y 18 grupos de mosquitos dieron positivo a WNV-1 y USUV, respectivamente (de 114 analizados), mientras que la colección de los CDC informó 2 de 15 mosquitos. grupos positivos para USUV, únicamente (Tabla 2).

En cuanto a las tarjetas FTA, en 2019 una tarjeta dio positivo a WNV-2 y otra a USUV (de 72 analizadas), mientras que en 2021 solo dos tarjetas dieron positivo a USUV (de 25 analizadas). Cabe señalar que en Badia Polesine (muestreo de 2019), la tarjeta FTA positiva para WNV-2 no se asoció con mosquitos positivos recolectados por la misma trampa (Tablas 1 y 2).

En ambos años de muestreo, no se detectó Ae. albopictus fueron detectados positivos para WNV y USUV, u otros flavivirus (ZIKV, DENV), lo que coincide con los resultados negativos de las tarjetas FTA.

La tasa de infección por mosquitos agrupados, resultante del modelo MLE, calculado para BG en 2019 para toda el área de estudio, osciló entre 0 y 1,97 para USUV y entre 0 y 1,42 para WNV-2. En 2021, el MLE calculado para USUV y WNV-1 fue de 2,71 a 6,86 y de 1,19 a 3,01, respectivamente.

La trampa BG modificada fue considerablemente más eficiente que la trampa CDC en la recolección de Ae. albopictus y An. maculipennis sl y mostró un comportamiento similar con Cx. modesto y Oc. caspius, especie vectora secundaria de WNV y USUV57. La trampa BG también mostró el mejor desempeño en términos de diversidad de especies. Estos hallazgos son consistentes con los resultados de diferentes estudios realizados utilizando trampas BG-Sentinel estándar44,58,59,60,61,62,63. La trampa CDC fue la mejor opción para atacar a Cx. pipiens en nuestro estudio, confirmando datos de la literatura44,63,64. El menor rendimiento de la trampa BG en la recolección de Cx. pipiens podría superarse utilizando la trampa durante al menos dos días consecutivos. Sin embargo, otros estudios mostraron un rendimiento similar o mejor del BG en comparación con la trampa CDC60,65,66, lo que indica la dependencia ambiental de los sistemas de captura que se debe tener en cuenta cuando se establece un plan de muestreo en una nueva área.

Una limitación no despreciable de la vigilancia de mosquitos es la calidad morfológica de los especímenes recolectados. En nuestro estudio, el número de mosquitos no identificados a nivel de especie disminuyó significativamente cuando se recolectaron con la trampa BG, debido a la mejor conservación de las muestras, lo cual es una propiedad aconsejable y relevante para análisis posteriores, especialmente en la detección de arbovirus. Esta característica probablemente se debe a la alta viabilidad de los mosquitos atrapados, de acuerdo con hallazgos anteriores42. En un sistema basado en tarjetas FTA, la viabilidad de los mosquitos en una trampa que funciona durante varios días consecutivos aumenta las posibilidades de que los mosquitos atrapados se alimenten de azúcar y, por lo tanto, la liberación de patógenos en la tarjeta FTA. Esta es también una característica deseable en la perspectiva de implementar un sistema de vigilancia que no requiera la recolección rápida de mosquitos para evitar la degradación del ARN viral en condiciones de campo.

El buen funcionamiento del sistema de alimentación de la trampa BG aquí presentada se confirma por las altas tasas de alimentación de azúcar detectadas en el campo (todas las especies 80%, Cx. pipiens 73%, Ae. albopictus 76%), que ha demostrado ser uniforme. superior a lo observado en las pruebas preliminares de laboratorio realizadas en Ae. albopictus (58%, Archivo complementario 1: Tabla S1). Esta tasa de alimentación también es consistente con otros estudios realizados con diferentes sistemas de captura27,33,37,41. Además, la tasa de alimentación aquí informada probablemente podría estar subestimada si se compara con el número real de mosquitos que pueden haber liberado saliva en las tarjetas FTA. Según la literatura, los patógenos podrían detectarse en la tarjeta FTA incluso en ausencia de una harina de azúcar visible27,30,67. Esto puede explicarse por varios factores: (i) el sondeo del mosquito es suficiente para liberar patógenos con la saliva, aunque en realidad no se haya producido la harina de azúcar; (ii) en ausencia de disección de muestras en laboratorio, la detección a simple vista de mosquitos teñidos podría no ser factible, particularmente en el caso de especies con patrones oscuros; (iii) una ingesta parcial de azúcar o un proceso de digestión avanzado pueden afectar el color del tinte, que se vuelve ligeramente visible o ausente sin disección. Las estimaciones no corregidas de las tasas de alimentación con azúcar también podrían estar relacionadas con las especies recolectadas. Las diferencias observadas entre especies al tomar una comida azucarada sobre el soporte artificial también podrían estar relacionadas con comportamientos o características fisiológicas específicas de cada especie, como la fuente de azúcar preferida y/o el tiempo necesario para pasar hambre. Esto concuerda con un estudio de laboratorio de Melanson et al.67, donde el 90% de los Ae. aegypti tomó una comida azucarada en la tarjeta FTA después de las 6 h, mientras que en An. stephensi, la tasa de alimentación observada fue sólo del 37% después de 24 h y del 45% después de 65 h, aunque ambas especies estuvieron privadas de azúcar al mismo tiempo.

La capacidad general de la tarjeta FTA en nuestro sistema de captura para detectar arbovirus fue satisfactoria, pudiendo detectar los únicos virus conocidos transmitidos por mosquitos que circulan en el área de estudio (es decir, WNV y USUV). Sin embargo, en nuestro estudio, el sistema de tarjeta FTA mostró una sensibilidad general más baja en comparación con el análisis de mosquitos en piscina, lo que está en línea con otra evidencia bibliográfica30,68.

Varios factores pueden explicar este fenómeno. Para que un mosquito infectado libere un virus, el patógeno primero debe replicarse en el vector después de ingerir sangre y luego diseminarse por todo el cuerpo hasta llegar a las glándulas salivales. En consecuencia, el título viral en la saliva es menor en comparación con el del cuerpo entero del mosquito, lo que hace que sea más difícil de detectar con cargas virales bajas. También cabe señalar que la detección de virus moleculares en toda la carcasa del mosquito no indica necesariamente la infectividad del mosquito. Por lo tanto, una tarjeta FTA positiva puede actuar como indicador de mosquitos realmente infecciosos en un área definida, incluso con un retraso temporal en comparación con el método estándar basado en el análisis completo de mosquitos. De hecho, las tarjetas FTA detectaron USUV al mismo tiempo que los valores más altos de MLE, aunque el pequeño número de eventos positivos no permitió el análisis estadístico. De hecho, en 2019, la detección de USUV con tarjeta FTA se informó en un sitio con el valor MLE más alto (MLE: 1,97), mientras que en 2021 las tarjetas FTA positivas se observaron en semanas con valores MLE más altos (MLE: 4,82, 6,86). Esto sugiere que, con el esfuerzo de muestreo probado en este estudio, fue posible detectar el virus USUV cuando su presencia en los vectores era alta. Por esta razón, esta estrategia puede recomendarse sólo con el esfuerzo de muestreo adecuado, para compensar la menor sensibilidad del enfoque FTA y poder reaccionar rápidamente cuando el virus comience a circular en los mosquitos. Esto es particularmente cierto en el caso de la vigilancia integrada del VNO, donde es obligatoria una detección temprana de la circulación viral para reducir el riesgo de transmisión interhumana a través de la donación de sangre, tejidos y órganos69. Según nuestros resultados, dos días de muestreo parecen ser suficientes para obtener números comparables de grupos de mosquitos positivos con el BG (MLE: USUV = 0,51, WNV = 0,25) y la trampa CDC (MLE: USUV = 0,62 WNV = 0,31). Sin embargo, durante ambos años de muestreo, la tarjeta FTA no logró detectar el virus en la mayoría de las trampas positivas. Aumentar el número de trampas de BG en un sitio tendría la doble ventaja de aumentar la probabilidad de recolectar mosquitos positivos y la posibilidad de detectar patógenos en las tarjetas FTA. Esto se debe a que: (1) si un mosquito recolectado aún no muere de hambre, el mayor tiempo de cautiverio aumentará las posibilidades de que se alimente con azúcar; (2) si la carga viral del mosquito es baja, más intentos de alimentación podrían liberar más virus en la tarjeta FTA; (3) si un mosquito recién infectado permanece vivo en la trampa durante unos días, la replicación del virus continuará y finalmente será detectable en la saliva.

Entre los flavivirus que circulan en el área muestreada, se observó una mayor prevalencia de USUV en comparación con WNV en ambos años de muestreo.

Con respecto a los linajes del WNV, los resultados de las tarjetas FTA no se superpusieron completamente con aquellos con grupos de mosquitos. De hecho, en 2019, tanto las tarjetas FTA como los grupos de mosquitos dieron positivo para WNV-2, mientras que en 2021 el WNV-1 fue el único linaje encontrado (en los grupos de mosquitos, pero no en las tarjetas FTA). Curiosamente, el WNV-1 fue el único linaje reportado en Italia entre 1998 y 201170,71, y luego fue reemplazado en gran medida por la introducción del WNV-271,72,73,74. El último registro de WNV-1 en un grupo de mosquitos se produjo en la provincia de Piacenza en 2017, y esta es la primera evidencia de una cepa recientemente introducida en el noreste de Italia desde entonces75. Este linaje WNV-1 mostró la mayor similitud con el genoma de un aislado de WNV-1 identificado en 2015 en la región de Camargue (Francia)76, lo que indica la capacidad del enfoque BG-FTA para detectar una cepa de arbovirus recientemente introducida en el área muestreada.

En este estudio, demostramos que un sistema de captura basado en una trampa centinela BG modificada para llevar una tarjeta FTA puede ser una herramienta eficaz para la vigilancia de patógenos transmitidos por mosquitos al explotar el comportamiento de alimentación de azúcar de los mosquitos. Esta trampa modificada mostró un rendimiento confiable en la recolección de mosquitos pertenecientes a varias especies de vectores (Cx. pipiens, Ae. albopictus, Cx. modestus, An. maculipennis sl y Oc. caspius), observándose buenas tasas de alimentación de azúcar en todas las especies.

Este enfoque puede tener algunas limitaciones en un contexto de baja densidad de mosquitos, particularmente en áreas de posible introducción de patógenos. En contextos como estos, el BG-Sentinel con tarjeta FTA puede carecer de la sensibilidad suficiente como sistema de alerta temprana, donde el hallazgo ocasional de mosquitos infecciosos en una nueva zona podría pasar desapercibido.

Aunque la sensibilidad de la tarjeta FTA es menor que la del análisis de grupos de mosquitos, este método podría ser ventajoso en muchos contextos de vigilancia de arbovirus debido al almacenamiento a largo plazo de ARN en condiciones de campo y al menor esfuerzo en el manejo y análisis de muestras. En particular, el BG-Sentinel con tarjeta FTA podría resultar ventajoso en ausencia de herramientas adecuadas para la conservación y análisis de mosquitos in situ (por ejemplo, cuando no es posible mantener una cadena de frío), lo cual es particularmente deseable en áreas remotas (donde la necesidad de una fuente de alimentación para el funcionamiento de la trampa se podría solucionar con un panel solar). Además, este enfoque puede ser útil en contextos donde la carga de trabajo requerida para procesar un gran número de mosquitos en poco tiempo es demasiado alta (por ejemplo, en áreas grandes o con altas densidades de mosquitos), así como en la detección rápida de patógenos transmitidos por mosquitos. en puntos críticos con riesgo de introducción de nuevos patógenos (por ejemplo, puertos, estaciones de tren, aeropuertos, etc.).

Finalmente, este sistema de vigilancia, que funcionó bien en una zona endémica para WNV y USUV, podría ser particularmente útil para los arbovirus transmitidos por Ae. albopictus y Ae. aegypti, especie para la cual la trampa BG-Sentinel es una herramienta de captura muy eficiente58,59,62,77. Dados los brotes de CHIKV y DENV ocurridos en Europa en el pasado reciente3,4,5,6,78, el enfoque propuesto tiene el potencial de ser altamente efectivo en una perspectiva de vigilancia de “objetivos múltiples”, tanto en áreas tropicales endémicas como en contextos templados en riesgo de brotes del virus transmitido por Aedes.

Los datos que respaldan las conclusiones de este artículo se incluyen dentro del artículo y sus archivos adicionales. Los conjuntos de datos utilizados y analizados durante el presente estudio están disponibles del autor correspondiente previa solicitud razonable.

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Descargar referencias

Agradecemos al personal del Istituto Zooprofilattico delle Venezie (IZSV), de la oficina de Inteligencia Médica—Stato Maggiore della Difesa (MI-SMD) y del Departamento Científico—Ospedale Military del Celio (DS-OMC) por su apoyo. Agradecemos especialmente a Gioia Capelli (IZSV), Patrizia Danesi (IZSV), Onofrio Zaccaria (MI-SMD), Vincenzo Abate (MI-SMD) y Nino D'Amore (DS-OMC) por su continua disponibilidad durante todo el curso. de este estudio.

Este estudio fue apoyado por: Ministerio de Defensa italiano, Programma Nazionale per la Ricerca Militare (PNRM) 2017, proyecto “SENSOR”, n. a2016.140 (IP Marco Pombi); Royal Society International Exchanges 2021, proyecto “Optimización de estrategias de muestreo para la vigilancia de enfermedades transmitidas por mosquitos”, n. IES\R3\213033 (PI Luca Nelli).

Departamento de Salud Pública y Enfermedades Infecciosas, Universidad La Sapienza de Roma, Roma, Italia

Sara Manzi y Marco Pompi

Escuela de Biodiversidad, One Health y Medicina Veterinaria, Universidad de Glasgow, Glasgow, Reino Unido

Lucas Nelli

Departamento de Enfermedades Infecciosas, Istituto Superiore di Sanità, Roma, Italia

Claudia Fortuna, Francesco Severini, Luciano Toma y M. Di Luca

Instituto Zooprofiláctico Experimental Delle Venezie, Legnaro, Italia

Alice Michelutti, Michela Bertola, Francesco Gradoni, Federica Toniolo, Sofia Sgubin y Fabrizio Montarsi

Instituto de Ciencias Biomédicas de Defensa, Roma, Italia

Florigio Lista

Estado Mayor de Defensa, Roma, Italia

Michele Pazienza

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M.Po., FM, M.Pa., FL concibieron el estudio. M.Po., SM, FS, LT, MDL desarrollaron el prototipo de trampa. M.Po., SM, FS, LT y MDL realizaron análisis entomológicos de laboratorio. M.Po. y FM organizó y supervisó colecciones de campo. SM, MB, AM y FG llevaron a cabo la recolección de campo y la identificación morfológica de muestras entomológicas. SM, CF, FT y SS realizaron análisis moleculares. SM y LN analizaron los datos entomológicos. SM, LN y M.Po. redactó el manuscrito. Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito final.

Correspondencia a Marco Pompi.

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Manzi, S., Nelli, L., Fortuna, C. et al. Una trampa BG-Sentinel modificada equipada con una tarjeta FTA como herramienta novedosa para la vigilancia de enfermedades transmitidas por mosquitos: una prueba de campo para la detección de flavivirus. Informe científico 13, 12840 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-39857-1

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Recibido: 29 de marzo de 2023

Aceptado: 01 de agosto de 2023

Publicado: 08 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-39857-1

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